FFPE提取 FFPE樣本DNA提取

時間：2022-06-30作者：南京兔牙生物科技有限公司瀏覽：513

FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）樣本是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常見的生物材料。此類樣本已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高通量測序、原位雜交、*組織化學(xué)等研究領(lǐng)域。目前據(jù)估計，**約有數(shù)十億FFPE組織樣本保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中，這些組織樣本是疾病診斷和科學(xué)研究的較為寶貴的的生物學(xué)資源之一。

FFPE樣本
隨著基因組學(xué)檢測技術(shù)的快速發(fā)展，尤其新一代測序技術(shù)（NGS）的飛速發(fā)展，在細(xì)胞分子水平提供了前/所未有的檢測能力，研究人員可以使用這一技術(shù)手段對FFPE樣本進(jìn)行研究，尋找與疾病相關(guān)的基因突變。下面讓我們來詳細(xì)了解一下FFPE樣本從制備到檢測分析相關(guān)知識點及注意事項。
FFPE樣本的制備、核酸提取及分析流程如下：




Q1：FFPE樣本的制備

樣本采集
從病人身上獲得組織標(biāo)本的手術(shù)涉及麻醉、血管結(jié)扎、組織的切除以及固定。從取樣到組織固定這段時間內(nèi)，組織中的基因表達(dá)可能發(fā)生變化，且可能發(fā)生組織自溶，因此，組織固定前的操作時間應(yīng)當(dāng)越短越好，以避免核酸和蛋白表達(dá)譜發(fā)生明顯改變。

福爾馬林固定
組織的固定使用的是福爾馬林溶液。為了獲得較佳的固定結(jié)果，應(yīng)當(dāng)使用中性的福爾馬林緩沖溶液，以取代無緩沖或酸性的溶液。組織在一定濃度的福爾馬林溶液中，核酸之間、蛋白質(zhì)之間、以及核酸和蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生一定程度的交聯(lián)，固定時間越長，交聯(lián)程度越大。
石蠟包埋

福爾馬林固定之后，需要用石蠟將組織進(jìn)行包埋，此過程包含脫水、透明、浸蠟和包埋。第一步是脫水，其中水被替換成醇類，通常為乙醇。接著是透明，其中醇類被替換成二甲苯或二甲苯替代物，之后是浸蠟，其中二甲苯被置換成石蠟。最后一步是包埋，整個標(biāo)本被石蠟包圍。在浸蠟之前，組織標(biāo)本必須完全脫水，因為殘留的水分可能導(dǎo)致樣品降解。石蠟包埋是維持蛋白完整性的關(guān)鍵一步，因為殘留的水分可能導(dǎo)致蛋白水解。


在固定和包埋之后，F(xiàn)FPE樣品較好應(yīng)在較佳溫度下保存，這樣可減緩核酸和蛋白的降解。有研究表明FFPE樣品保存在4°C，而不是室溫或較高，則RNA在1年后仍基本完整。
從FFPE樣品中提取出的核酸和蛋白的質(zhì)量取決于固定和包埋之前、期間和之后如何處理樣品，樣本如果未處理好，會造成核酸嚴(yán)重片段化，我們需要對處理后的樣本進(jìn)行質(zhì)控，以便后續(xù)開展核酸提取和測序等下游應(yīng)用。




Q2：FFPE樣本核酸提取

樣本切片

石蠟樣本在提取前需要進(jìn)行切片處理，一般需要5-6個切片，一片鏡檢確定**細(xì)胞含量，其他進(jìn)行后續(xù)提取處理，切片的薄厚程度對后續(xù)觀察和提取會有一定影響。


脫蠟和水化




因為FFPE樣本的特殊性，石蠟會阻礙消化液對組織的滲透，從而抑制蛋白酶K和組織內(nèi)蛋白的接觸，影響到組織消化和核酸的釋放。為消除石蠟對DNA提取和PCR擴增的不良影響，必須組織進(jìn)行徹底的脫蠟。


蛋白酶K消化




為了將DNA與結(jié)合的蛋白質(zhì)分離，F(xiàn)FPE樣本需經(jīng)受高溫和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白質(zhì)組分以及樣品中可能存在的任何核酸酶，這個步驟還可防止DNA發(fā)生降解。注意要把握好消化時間，可以根據(jù)組織類型、組織大小進(jìn)行調(diào)節(jié)，使DNA充分釋放。




基因組DNA純化
FFPE樣本中核酸和蛋白質(zhì)是緊密交聯(lián)在一起的，進(jìn)行組織消化后樣品已經(jīng)變成水化狀態(tài)，此時需要進(jìn)行震蕩解交聯(lián)，釋放DNA用于后續(xù)純化。如果可能的話，因交聯(lián)而引起的化學(xué)修飾也應(yīng)當(dāng)逆轉(zhuǎn)，因為化學(xué)修飾的DNA不能在純化過程中高效回收，而且在PCR或其他酶學(xué)分析中是一個不佳的底物，在斷裂交聯(lián)和逆轉(zhuǎn)化學(xué)修飾時必須小心，因劇烈的反應(yīng)條件可能導(dǎo)致DNA的進(jìn)一步片段化。

核酸提取
根據(jù)不同的研究目的選取相應(yīng)的方法提取DNA，常用的有酚氯/仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等。





FFPE樣本的DNA品質(zhì)會顯著影響后續(xù)熒光定量或者二代測序文庫的構(gòu)建成功率和測序數(shù)據(jù)指標(biāo)。所以從FFPE樣本中提取出高質(zhì)量的DNA，是保證后續(xù)實驗成功的關(guān)鍵。



Q3：FFPE樣本二代建庫注意細(xì)節(jié)

DNA質(zhì)控

在建庫前需要先對DNA進(jìn)行質(zhì)檢，主要檢測DNA的總量（濃度）、完整性以及純度。DNA的建庫起始投入量不足、DNA有降解、存在雜質(zhì)污染等這些因素會影響建庫的成功率以及后續(xù)測序數(shù)據(jù)的表現(xiàn)。所以，濃度測定一定要準(zhǔn)確，目的是保證建庫投入量的準(zhǔn)確性。電泳檢測DNA如果有降解的話，需要根據(jù)降解程度來適當(dāng)調(diào)整后續(xù)DNA的打斷時間。如果存在蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)污染的話，需要用蛋白酶K、RNA酶等進(jìn)行消化、純化處理。目的都是為了在建庫前了解DNA的質(zhì)量，一方面可以提前采取措施提高建庫的成功率，另一方面當(dāng)后續(xù)實驗或者測序數(shù)據(jù)指標(biāo)出現(xiàn)問題時可以較好的追溯原因。

打斷前損傷修復(fù)

FFPE樣本在制備和保存過程中會使得基因組DNA發(fā)生一定程度的損傷，比如缺口、胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶等，為了提高文庫質(zhì)量，建議將DNA先用特定的酶混合物進(jìn)行修復(fù)，然后再進(jìn)行打斷。

打斷時間

FFPE樣本由于保存環(huán)境以及時間的不同，提取出來的DNA會發(fā)生不同程度的降解，所以在打斷的時候，打斷循環(huán)數(shù)（也就是打斷時間）需要根據(jù)DNA的降解程度進(jìn)行調(diào)整，使打斷后片段峰值盡量集中在預(yù)期的范圍之內(nèi)。



DNA損傷的變異數(shù)量和類型，如果忽略，可能會對較終結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，這對下游應(yīng)用比如測序的影響是巨大的：從簡單測序文庫構(gòu)建的失敗到虛假文庫的產(chǎn)生，較終導(dǎo)致結(jié)果的錯誤。




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