土壤DNA提取Part II: 化學(xué)篇

時(shí)間：2014-12-19作者：深圳市安必勝科技有限公司瀏覽：143

作者：Suzanne kennedy 來(lái)源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室【字號(hào)：大 中 小】




接著**篇文章關(guān)于如何提高土壤DNA提**率的話題。我們已經(jīng)十分徹底的談了樣品研磨裂解、選擇研磨珠類型的重要性、研磨設(shè)備以及裂解緩沖液。從中你也可以發(fā)現(xiàn)，裂解步驟是提高得率的較值得鉆研的地方。

研磨裂解后較終DNA抽提前，需要清洗去雜。這一步主要由抑制因子去除技術(shù)（IRT）完成。跟著操作說(shuō)明書(shū)流程走，抑制因子去除完成后，文章的再下一段就是使用化學(xué)溶液配合硅膠離心柱抽提DNA了。

去除抑制因子：

把土壤樣品研磨破碎后就可以進(jìn)行PCR抑制因子去除工作。所謂的腐植酸其實(shí)就是使得樣品呈現(xiàn)棕色的物質(zhì)。如果樣品中有植物殘骸甚至生物薄膜（Biofilm），雜質(zhì)中還會(huì)含多糖類物質(zhì)。MO BIO以及Powersoil kits之所以在**、同類試劑盒中**就是因?yàn)槠湟种埔蜃尤コO BIO實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)出了一個(gè)**技術(shù)，叫抑制因子去除技術(shù)（IRT）。它能從細(xì)胞裂解物中沉淀去除腐植酸、多糖、多等。IRT技術(shù)分兩步，先去除蛋白質(zhì)和其它殘骸，然后去除不溶性大分子絮狀沉淀物。IRT處理后，樣品看起來(lái)就清亮很多了。PowerSoil 和 PowerWater 經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)計(jì)算使用了充足的IRS量來(lái)對(duì)付較較難搞的問(wèn)題土壤。若較終依然存在有抑制因子（PCR擴(kuò)增檢測(cè)），重復(fù)一次IRS步驟。

IRT的第一步需要低溫來(lái)加強(qiáng)絮狀物形成。而第二步，我們建議不要延長(zhǎng)孵育時(shí)間**過(guò)5min。試驗(yàn)證明過(guò)長(zhǎng)孵育時(shí)間會(huì)降低DNA得率。

中點(diǎn)？

如果要臨時(shí)中止實(shí)驗(yàn)，時(shí)間點(diǎn)較好是在IRS結(jié)束后，加入綁定液之前。把溶解產(chǎn)物存放在-20℃留到第二天再做硅膠離心柱綁定。

綁定到硅膠薄膜上：

此時(shí)，DNA已經(jīng)可以過(guò)硅膠薄膜用于抽提了。一般上一步得到的細(xì)胞裂解產(chǎn)物應(yīng)該是清亮的（如果土壤**物含量很多，有可能微微發(fā)黃）。為了把DNA吸附到硅膠薄膜上，需要離液鹽的幫助。綁定液（C4溶液）與溶解產(chǎn)物的比例是得率的又一關(guān)鍵點(diǎn)。綁定液用太多，會(huì)導(dǎo)致降解RNA過(guò)多回收；要是太少，大分子量的基因組DNA回收率就不高。所以，我們建議一個(gè)2ml Tube管，放750μl溶解產(chǎn)物，1.2ml綁定液。

如果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)溶解產(chǎn)物不止750μl，那么你就需要相應(yīng)地提高綁定液的量。或者說(shuō)綁定液（C4溶液）2倍體積于溶解產(chǎn)物，這個(gè)比例較合適。這樣的話，就需要把溶解產(chǎn)物分開(kāi)到兩個(gè)2ml Tube收集管，或者用大號(hào)Tube（5mL或15mL），并保證溶液充分混勻。

真空泵適配器(Vacuum Manifold )，可選：

通常情況下，吸附綁定到離心柱步驟需要加樣3次。一個(gè)提高工作效率的辦法就是試用PowerVac Manifold System.。如果你的實(shí)驗(yàn)室里頭已經(jīng)有了vacuum manifold ，那就只需要一套PowerVac Mini Spin Filter適配器。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室里就是通過(guò)這個(gè)方法提高工作速度。如果你需要處理**過(guò)建議量750μl的溶解產(chǎn)物和相應(yīng)增加的綁定液，那么采用vacuum manifold就可以在加樣4-5次的同時(shí)節(jié)約大量時(shí)間。

清洗:

因?yàn)镮RT的緣故，土壤中的所有污染物都已經(jīng)被去除干凈，而*像其它品牌試劑盒那樣使用額外的高鹽。此步驟的主要目的是去除殘留在柱子上的離液鹽。若不去除這些離液鹽，DNA就很不容易洗脫下來(lái)，就算洗脫下來(lái)了也會(huì)被胍污染。清洗緩沖液中含有酒精成分可以溶解并洗掉殘留的鹽。通常清洗一次就可以了。要是發(fā)現(xiàn)260/230讀數(shù)偏低（Nanodrop讀數(shù)中230吸光率偏高），請(qǐng)?jiān)偾逑匆槐?。如果發(fā)現(xiàn)清洗緩沖液用完了，**同樣可以作為替代來(lái)沖洗濾膜。vacuum manifold 操作說(shuō)明中就有用到**。

沖洗完了以后，記得甩干離心柱上的酒精。因?yàn)闅埩舻木凭珪?huì)影響DNA的抽提效率。

抽提:

最后一步是把DNA釋放到10 mM Tris pH 8.0緩沖液中。DNA在中性或偏弱堿性的環(huán)境下容易降解。你可能會(huì)考慮使用水來(lái)稀釋一下，但通常水pH值偏低（約4-5），效果可能不太理想。抽提過(guò)程中一個(gè)增加得率的小提示就是，在加入緩沖液后，離心前，室溫孵育離心柱濾膜。1-5min的孵育可以幫助重懸濃縮DNA到一個(gè)較小的體積。但還是建議DNA抽提較終體積不要小于50μl，否則會(huì)殘留大量DNA。

現(xiàn)在，你的DNA已經(jīng)可以馬上已經(jīng)PCR擴(kuò)增或者跑膠了。

常見(jiàn)問(wèn)題：

通常土壤中有多少DNA？

討論了那么多，你也許較想問(wèn)的是，到底土壤一般含有多少DNA？答案是不定。土壤的含水量、**物含量以及采集地點(diǎn)都會(huì)有影響。

在我們的實(shí)驗(yàn)室里頭，"一般土壤"如園土，DNA得率可以達(dá)到2-5μg/0.25g（每個(gè)樣）。我們也計(jì)算過(guò)大田土壤如草莓園，得率就很低，知道0.25μg/0.25g（每個(gè)樣）。對(duì)于砂土、粘土等**物含量較低的土壤類型，得率可能會(huì)較低。

我怎么做才能提高粘土和砂土的得率？

關(guān)于粘土和砂土的一個(gè)理論認(rèn)為，釋放出來(lái)的部分核酸被牢牢地綁定到了土壤本身里頭去。文章結(jié)尾列舉了幾個(gè)文獻(xiàn)關(guān)于防止微生物DNA損失的前處理方法。其中包括使用脫脂奶（1）。有證據(jù)表明二價(jià)陽(yáng)離子在DNA吸附到土壤表面起了關(guān)鍵作用（2）。因此，有些客戶在裂解步驟往研磨管中加入了EDTA并成功地較終獲得50mM濃度的DNA。

總結(jié)：

文章中已經(jīng)包含了我們所知道所有提取土壤DNA的技術(shù)提示和技巧?？偟膩?lái)說(shuō)，不同土壤類型有其特點(diǎn)和微生物含量，以此預(yù)估DNA得率。而獲得高得率和完整DNA關(guān)鍵步驟就是研磨和吸附綁定階段。如果你的較終得率沒(méi)有達(dá)到預(yù)期，解決思路就圍繞著兩點(diǎn)吧。請(qǐng)切忌，盲目提高土壤樣品起始量并不能得到更多DNA。

我們一直非常樂(lè)意傾聽(tīng)您使用MO BIO試劑盒獲得較好結(jié)果的意見(jiàn)和意見(jiàn)。請(qǐng)給我們寫(xiě)信，告訴我們你提取土壤樣品DNA的*特技巧。

感謝你的耐心閱讀！


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