百螢Annexin V-mFluor Violet 540標記實驗方案

時間：2024-06-20

一、百螢Annexin V-mFluorViolet 540標記概述

百螢Annexin V-mFluorViolet 540標記探針用于檢測細胞功能的探針膜聯(lián)蛋白是在鈣存在下與磷脂膜結合的蛋白質家族。Annexin V 是研究細胞凋亡的重要工具。它用作檢測在細胞表面表達磷脂酰絲酸的細胞的探針，這是在細胞凋亡和其他形式的細胞死亡中發(fā)現(xiàn)的特征。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測細胞活力。Annexin V 染料偶聯(lián)物廣泛用于通過測量磷脂酰絲酸 (PS) 的易位來監(jiān)測細胞凋亡。在細胞凋亡中，PS 被轉移到質膜的外層。細胞表面磷脂酰絲酸的出現(xiàn)是細胞凋亡初期/中期的普遍指標，可以在觀察到形態(tài)學變化之前檢測到。這種熒光膜聯(lián)蛋白 V 結合物具有類似于 Pacific Orange?（Pacific Orange? 是 Invitrogen 的商標）的光譜特性。橙色熒光染色在 405 nm 的紫色激光下很好地激發(fā)，并在 ~560 nm 發(fā)出強烈的藍色熒光。

二、百螢Annexin V-mFluor Violet 540實驗方案

分析方案

概述

用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞

添加Annexin V結合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM l和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。

1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。

1.4將細胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結合物。

可選：在細胞內加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

2.使用流式細胞儀分析：

通過使用具有適當過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V結合流式細胞術分析未經常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前報道了利用膜聯(lián)蛋白V對貼壁細胞類型進行流式細胞術的方法。和van Engelend等人（見參考文獻1和2）。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉蓋玻片并觀察細胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞

三、百螢Annexin V-mFluorViolet 540標記光譜特性

吸光度（納米）	401
校正因子（260nm）	1.326
校正因子（280nm）	0.543
消光系數(shù)（cm^-1M^-1）	18000¹
激發(fā)（納米）	402
**（納米）	535
產率	0.21¹

詞條
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