百螢問號-- Annexin V-AF488標記實驗方案是怎樣的

時間：2024-07-02作者：西安百螢生物科技有限公司瀏覽：17

百螢  Annexin V-AF488標記參數(shù)：

Ex(nm)：499

E m(nm)：520

分子 量：~36000

溶   劑：Water

存儲條件：在零下15度以下保存，避免光照

百螢  Annexin V-AF488適用儀器

（1）流式細胞儀                                

激發(fā)：488nm激光                         

**：530/30nm濾波片                     

通道：FITC通道

（2）熒光顯微鏡

孔板：黑色透明

通    道：Pacific Blue通道

百螢  Annexin V-AF488實驗方案

概述

用測試化合物（200μL/樣品）制備細胞

添加Annexin V結(jié)合物測定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析

 

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液：10mM HEPES，140mM l和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測試化合物處理細胞一段所需的時間（用星形孢菌素處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導細胞凋亡。

1.3離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。

1.4將細胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細胞內(nèi)加入死細胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細胞儀或熒光顯微鏡分析細胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測熒光強度（參見下面的步驟2或3）。

 

2.使用流式細胞儀分析：

通過使用具有適當過濾器的流式細胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測，因為在細胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。

 

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細胞。 將細胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對于粘附細胞，建議直接在蓋玻片上生長細胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細胞。 在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細胞。


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