通過流式細胞術進行PBMC表型分析

時間：2023-10-23

通過流式細胞術進行 PBMC（外周血單核細胞）分析可廣泛應用于研究和臨床研究，包括 HIV 研究、癌癥和基于細胞因子的反應的基礎研究。PBMCs通常通過密度梯度離心或磁珠分離從外周血、骨髓和臍帶中提取。這些方法旨在將白細胞與紅細胞 (RBC) 等其他細胞成分分離。

流式細胞術的一個常見應用是 PBMC 表型分析。該技術測量被稱為“分化簇”(CD) 標記的細胞表面分子的表達，以識別、區(qū)分和表征 PBMC 亞群。除了 CD 標記表達之外，計數(shù)和細胞大小的監(jiān)測對于該分析也至關重要。其中一個例子是嵌合抗原受體 T (CAR-T) 細胞癌癥領域。

為了表征 PBMC 上的 CD 標記，將針對 CD 標記的抗體與藻紅蛋白 (PE) 等熒光團綴合。然后使用流式細胞儀測量熒光強度，以量化 CD 標記表達水平并區(qū)分 PBMC 亞群。本應用說明演示了用于表征 PBMC 上 CD 標記的單熒光團和雙熒光團 PBMC 染色技術。

CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的制備

PBMC 染色：

1. 在標記之前，使用臺盼藍染料排除測試（2452）確定 PBMC 活力，每個樣品使用 100 萬個細胞。

2. 用 HHBS 緩沖液（ 20011）通過離心機以 1000 RPM 洗滌 PBMC 2 次，每次洗滌 5 分鐘。

3. 為了阻斷非特異性 Fc 介導的相互作用，將 PBMC 重懸于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 緩沖液和 Human TruStain FcX? 5 μL/100 μL 檢測緩沖液中，并在室溫10分鐘。

4. 對于單熒光團 PBMC 染色，將 PBMC 與終濃度 0.1 μg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分鐘。

5. 對于雙熒光團 PBMC 染色，將 PBMC 與 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四種染料的終濃度均為 0.5 μg，在冰上避光保存 20 分鐘。用 Assay Buffer 清洗 PBMC 兩次，然后將 PBMC 重懸于 Assay Buffer 中。

6. 在流式細胞儀上進行分析。

使用 Buccutite? 綴合技術生成的綴合物可提供高質(zhì)量的產(chǎn)量。這些綴合物在 PBMC 上進行了測試，并且可以靈活地與其他綴合物組合進行多色染色，以檢測 PBMC 中的 CD 標記。

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使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用單熒光團和雙熒光團對 PBMC 進行流式細胞術分析。密度圖（左邊）用于從其他細胞群中排除淋巴細胞。直方圖（右上）和密度圖（右下）分別用于單次和多次熒光團染色。數(shù)據(jù)記錄在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式細胞儀上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版進行分析。

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