保健食品原料用菌種安全性 檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）

時(shí)間：2020-10-31作者：北京天健華成國(guó)際貿(mào)易咨詢有限公司瀏覽：98

保健食品原料用菌種安全性

檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（2020年版）

 

1 范圍

本指導(dǎo)原則規(guī)定了保健食品原料用細(xì)菌、絲狀真菌（子實(shí)體除外）和酵母的安全性評(píng)價(jià)中的致病性（毒力）檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)程序和方法。

本指導(dǎo)原則適用于保健食品原料用菌種（包括保健食品配方用及原料生產(chǎn)用菌種）的致病性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)。

本指導(dǎo)原則不適用于基因改造微生物菌種和在我國(guó)無(wú)使用習(xí)慣的菌種致病性檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)。

2 術(shù)語(yǔ)和定義

2.1 致病性，Pathogenicity

微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。

2.2 產(chǎn)毒能力，Toxigenicity

微生物產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物有毒作用的活性代謝產(chǎn)物的能力。

2.3 毒性，Toxicity

微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體可能造成的潛在傷害（不良反應(yīng)）。

3 對(duì)擬評(píng)價(jià)微生物菌種需提交的基本資料要求

在進(jìn)行致病性評(píng)價(jià)試驗(yàn)前，菌種送檢單位需提供以下資料供評(píng)價(jià)單位審核。

3.1 基本信息

擬評(píng)價(jià)菌種名稱（包括學(xué)名、俗名、曾用名、拉丁名等）、來(lái)源及用途。

3.2 菌種分類學(xué)資料

提供由有菌種鑒定資質(zhì)的機(jī)構(gòu)出具的對(duì)擬評(píng)價(jià)菌種的規(guī)范、科學(xué)的分類學(xué)（屬、種名稱及株）資料。細(xì)菌的分類和命名應(yīng)遵循原核生物分類學(xué)國(guó)際**（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的規(guī)定，并符合原核生物國(guó)際命名法規(guī)（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。真菌的分類和命名應(yīng)按國(guó)際藻類、真菌和植物命名法規(guī)（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）進(jìn)行。

3.3 菌種鑒定資料

根據(jù)目前已有的知識(shí)，提供基于表型及基因測(cè)序技術(shù)鑒定到種水平的資料。作為保健食品的功效成分（活菌），還應(yīng)提供鑒定到株水平的資料。

3.4 菌種生長(zhǎng)環(huán)境條件資料

提供擬評(píng)價(jià)菌種生長(zhǎng)較適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和濕度、光照等），以及菌種保藏及復(fù)壯方法等相關(guān)資料。

3.5 誘變菌種

經(jīng)過(guò)誘變的菌種還需提供詳細(xì)的菌種誘變方法（包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變?cè)囼?yàn)流程等）和不少于100代（傳代間隔不少于7天）的遺傳穩(wěn)定性研究報(bào)告。

3.6 生產(chǎn)相關(guān)信息

包括但不限于擬評(píng)價(jià)菌種安全用于保健食品的生產(chǎn)記錄、工藝流程、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等資料。

3.7 國(guó)內(nèi)外安全性評(píng)價(jià)資料綜述

基于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，提供擬評(píng)價(jià)菌種的國(guó)內(nèi)外使用歷史和安全性評(píng)價(jià)資料，包括其致病性和產(chǎn)毒能力的報(bào)告、研究文獻(xiàn)或綜述等；若無(wú)擬評(píng)價(jià)菌種的上述資料，應(yīng)提供在親緣關(guān)系上與其相近種屬的安全性評(píng)價(jià)資料。

3.8 其他國(guó)家批準(zhǔn)資料

   提供其他國(guó)家已批準(zhǔn)擬評(píng)價(jià)菌種作為膳食補(bǔ)充劑、功能食品或普通食品生產(chǎn)使用的相關(guān)證明資料。

3.9 其他需要說(shuō)明的信息。

4 評(píng)價(jià)方法

對(duì)已經(jīng)提供以上資料的擬評(píng)價(jià)菌株，可以按照以下方法開展評(píng)價(jià)。

4.1 全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing, WGS）

4.1.1 基因測(cè)序

對(duì)擬評(píng)價(jià)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，分別獲得其基因組完成圖和框架圖，測(cè)序報(bào)告應(yīng)包括（但不限于）以下信息：

- DNA提取方法

- 測(cè)序方案及儀器設(shè)備

- 序列組裝方法

- 序列質(zhì)量評(píng)價(jià)

- FASTA文件

- 與預(yù)期基因組大小相關(guān)的重疊群（Contigs）總長(zhǎng)度

- 基因注釋流程

- 對(duì)真菌而言，還需提供從相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的全基因組注釋質(zhì)量信息。

4.1.2 基因序列分析

將擬評(píng)價(jià)菌株的全基因組序列與已有的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括但不限于毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)（VFDB）、毒力/致病島數(shù)據(jù)庫(kù)（PAIDB）、生物防御數(shù)據(jù)庫(kù)（MvirDB）等較新版本中存儲(chǔ)的序列進(jìn)行比對(duì)，并分析擬評(píng)價(jià)菌株遺傳物質(zhì)中與致病明確相關(guān)的已知毒力因子和毒素代謝相關(guān)基因的存在情況。應(yīng)提供包括（但不限于）以下信息的分析報(bào)告：

- 毒力/致病性（或產(chǎn)毒）相關(guān)基因名稱、所在位置、與較新數(shù)據(jù)庫(kù)中已有毒力基因的匹配度等信息

- 編碼的蛋白及序列號(hào)

- 毒力/致病因子（毒素產(chǎn)生、侵襲和粘附因子等）

- 序列長(zhǎng)度覆蓋度≥60%

- 輸入序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的匹配度（≥85%）和e值（<10-5）

- 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的菌株名稱

- 基因組圖譜

- 擬評(píng)價(jià)的真菌菌株還應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道能夠產(chǎn)生的毒素類別，針對(duì)性檢索是否存在毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇。

4.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

由具備菌種致病性檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)資質(zhì)的機(jī)構(gòu)，分別按照附錄A、附錄B和附錄C規(guī)定的試驗(yàn)方案，對(duì)擬評(píng)價(jià)的保健食品用細(xì)菌、絲狀真菌、酵母菌株開展致病性檢驗(yàn)，對(duì)結(jié)果做出評(píng)價(jià)并出具報(bào)告。

4.3 產(chǎn)毒試驗(yàn)

對(duì)某些能夠產(chǎn)生毒素的微生物，應(yīng)在多種基質(zhì)和條件下（單品種固體、多品種固體復(fù)合、不同成分的液體組合等）進(jìn)行產(chǎn)毒試驗(yàn)，并按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法或國(guó)際組織/相關(guān)國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行有毒活性代謝產(chǎn)物含量檢測(cè)。

5 結(jié)果判定

5.1 滿足以下所有條件者，可用于保健食品。

5.1.1 動(dòng)物試驗(yàn)顯示無(wú)致病性。

5.1.2 產(chǎn)毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，在受試的任何一種基質(zhì)中均不產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。

5.1.3 根據(jù)現(xiàn)有知識(shí)，全基因組序列分析未發(fā)現(xiàn)存在已知的毒力/致病基因（或毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇）。

5.2 全基因組序列中發(fā)現(xiàn)含有已知毒力/致病基因（或毒素合成關(guān)鍵基因及其基因簇），但動(dòng)物試驗(yàn)顯示不具有致病性、或產(chǎn)毒試驗(yàn)檢測(cè)到已知的有毒活性代謝產(chǎn)物但其水平較低，長(zhǎng)期攝入對(duì)人體健康無(wú)影響，結(jié)合國(guó)內(nèi)外使用歷史，可用于保健食品。

5.3 動(dòng)物試驗(yàn)顯示具有致病性，或產(chǎn)生高水平已知有毒代謝產(chǎn)物，長(zhǎng)期攝入可能影響人體健康，不能用于保健食品。

 

 

附錄A

(規(guī)范性附錄)

   保健食品原料用細(xì)菌致病性檢驗(yàn)方法

1 范圍

   本方法規(guī)定了保健食品原料用細(xì)菌的致病性檢驗(yàn)方法。

   本方法適用于保健食品原料用細(xì)菌的致病性檢驗(yàn)。

2 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌和培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備與材料如下：

2.1 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

2.2 離心機(jī)：離心力33000 ′ g。

2.3 電子天平：感量0.1 g 和0.001 g。

2.4 比濁儀。

2.5 溫濕度計(jì)。

2.6 顯微鏡：10×～100×。

2.7 厭氧培養(yǎng)裝置：厭氧罐、厭氧箱。

2.8 無(wú)菌錐形瓶：容量100 mL、500 mL。

2.9 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.10 無(wú)菌試管：16 mm×160 mm。

2.11 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

2.12 無(wú)菌量筒：容量100 mL。

2.13 微量移液器及配套槍頭：量程為100 μL～1000 μL。

2.14 注射器：量程為100 μL～1000 μL。

2.15 小鼠灌胃針頭。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15 min，備用。

3.2 LB肉湯培養(yǎng)基：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，備用。

3.3 LB瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB瓊脂平板，備用。

3.4 半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液：稱取500 mg半胱氨酸鹽酸鹽于50 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL蒸餾水，充分溶解后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用。

3.5 含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基：商品化MRS肉湯培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，加入按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液，使培養(yǎng)基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL，備用。

3.6 含有半胱氨酸鹽酸鹽MRS瓊脂平板：商品化MRS瓊脂培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，加入按3.4制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液，使培養(yǎng)基中半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL，用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板。

3.7 含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板：商品化雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，加入3.4中制備的半胱氨酸鹽酸鹽儲(chǔ)備液，使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為500 μg/mL，用于制備含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板。

4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)昆明或ICR健康成年小鼠，雌雄各半，體重范圍為18.0 g～22.0 g。

5 操作步驟

   所有擬評(píng)價(jià)的菌株必須使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑給予動(dòng)物受試物，以評(píng)價(jià)不同受試物暴露途徑對(duì)動(dòng)物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌株活化

目前我國(guó)已批準(zhǔn)的可用于保健食品的細(xì)菌主要是雙歧桿菌屬和乳桿菌屬，除這兩個(gè)屬以外的其他新申報(bào)菌種在以下描述中均使用“其他細(xì)菌”。

根據(jù)送檢菌株的保存狀態(tài)，將雙歧桿菌和乳桿菌首先接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯、其他細(xì)菌接種LB肉湯或適于該菌生長(zhǎng)的較適液體培養(yǎng)基中，并置適宜的培養(yǎng)條件下（包括培養(yǎng)溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養(yǎng)一定時(shí)間（培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異）。

5.1.2 菌懸液制備

將5.1.1中活化的雙歧桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板或含有半胱氨酸鹽酸鹽的雙歧桿菌瓊脂平板（乳桿菌接種含有半胱氨酸鹽酸鹽的MRS瓊脂平板，其他細(xì)菌接種LB瓊脂平板或適應(yīng)于該菌生長(zhǎng)的較適培養(yǎng)基瓊脂平板），在規(guī)定的適宜培養(yǎng)條件下（包括培養(yǎng)溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養(yǎng)一定時(shí)間（培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異）后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并比濁，使較終菌懸液中的菌濃度達(dá)到5.0×107 CFU/mL，用于小鼠腹腔注射。

5.1.3 注射

小鼠不少于40只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠無(wú)菌生理鹽水對(duì)照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠無(wú)菌生理鹽水對(duì)照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2 mL，即受試物組每只小鼠注射菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.4 觀察

動(dòng)物腹腔注射后每天觀察1次，至少連續(xù)觀察21 d。

觀察并記錄小鼠皮膚和毛、眼睛和粘膜、呼吸情況、肢體活動(dòng)、行為方式等有無(wú)異常。特別注意觀察是否出現(xiàn)振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現(xiàn)象。試驗(yàn)前稱量并記錄所有小鼠的體重，試驗(yàn)結(jié)束后稱量并記錄所有存活小鼠的體重。對(duì)于試驗(yàn)期間死亡的小鼠，盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間，同時(shí)稱重并記錄。

5.2 經(jīng)口灌胃

5.2.1 菌數(shù)預(yù)估

無(wú)菌吸取上述5.1.1的培養(yǎng)液，分別加至兩個(gè)無(wú)菌離心管中，每管1 mL，3000 ′ g 離心10 min，棄去上清液后，用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并比濁，使較終菌懸液中菌的濃度分別不**2.5×108 CFU/mL和1.25×109 CFU/mL，并分別記錄每mL培養(yǎng)液離心后所得沉淀物中細(xì)菌數(shù)調(diào)整至2.5×108 CFU/mL和1.25×109 CFU/mL時(shí)需加入的無(wú)菌生理鹽水的體積（mL）。

5.2.2 菌懸液制備

5.2.2.1 培養(yǎng)上清液的制備

根據(jù)受試動(dòng)物總數(shù)和每只動(dòng)物的灌胃體積計(jì)算所需要的受試菌株培養(yǎng)液用量。吸取5.1.1培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液一分為二，3000 ′ g 各離心10 min后，將上清液分別轉(zhuǎn)至100 mL無(wú)菌量筒中，一份上清液用于菌懸液原液的制備，另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之一，作為5倍濃縮上清液，備用。

5.2.2.2 菌懸液原液的制備

按照5.2.1中獲得的細(xì)菌終濃度達(dá)到2.5×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積，按相同比例加入5.2.2.1獲得的上清液，調(diào)整離心后的沉淀物使其細(xì)菌數(shù)達(dá)到2.5×108 CFU/mL（上清液量不夠時(shí)可用空白培養(yǎng)基補(bǔ)齊）。

5.2.2.3濃縮菌懸液的制備

按照5.2.1中獲得的細(xì)菌終濃度達(dá)到1.25×109 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積，按相同比例加入5.2.2.1獲得的5倍濃縮上清液，調(diào)整離心后的沉淀物使其細(xì)菌數(shù)達(dá)到1.25×109 CFU/mL。

5.2.3 灌胃

小鼠不少于80只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成8組（每組不少于10只），包括雄性小鼠培養(yǎng)基對(duì)照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠5倍濃縮培養(yǎng)基對(duì)照組、雄性小鼠5倍濃縮菌懸液組；雌性小鼠培養(yǎng)基對(duì)照組、雌性小鼠菌懸液組、雌性小鼠5倍濃縮培養(yǎng)基對(duì)照組、雌性小鼠5倍濃縮菌懸液組。各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃，連續(xù)灌胃3 d，**灌胃前小鼠應(yīng)禁食過(guò)夜（16 h），灌胃后3 h～4 h喂食。

5.2.4 觀察

動(dòng)物經(jīng)口灌胃后每天觀察1次，至少連續(xù)觀察21 d，觀察指標(biāo)同5.1.4。

6 結(jié)果與報(bào)告

對(duì)5.1和5.2的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和綜合評(píng)價(jià)，包括：

（1）受試物對(duì)動(dòng)物一般健康情況有無(wú)不良影響。

（2）受試物對(duì)動(dòng)物體重等指標(biāo)的影響。

（3）受試物組動(dòng)物死亡情況。

（4）若受試物組動(dòng)物在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，且體重等指標(biāo)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可判定該菌株無(wú)致病性；若受試物組動(dòng)物在試驗(yàn)期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，或試驗(yàn)期間體重等指標(biāo)與對(duì)照組相比有顯著性差異，即可判定該菌株具有致病性。

 

附錄B

(規(guī)范性附錄)

   保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗(yàn)方法

1 范圍

   本方法規(guī)定了保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗(yàn)方法。

   本方法適用于保健食品原料用絲狀真菌的致病性檢驗(yàn)。

2 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1 恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃。

2.2 電子天平：感量為0.1 g。

2.3 錐形瓶：容量為500 mL。

2.4 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5 顯微鏡：10×～100×。

2.6 微量移液器及配套槍頭：量程為100 μL～1000 μL。

2.7 血球計(jì)數(shù)板。

2.8 注射器：量程為100 μL～1000 μL。

2.9 小鼠灌胃針頭。

2.10 溫濕度計(jì)。

2.11 接種鉤。

2.12 球磨儀或功能相當(dāng)?shù)膬x器。

2.13 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 麥芽汁瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，備用。

3.3 無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15 min，備用。

如擬評(píng)價(jià)菌株在上述兩種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)和產(chǎn)孢子量均不理想，可選用適于該菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的其他培養(yǎng)基。

4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重范圍為18.0 g～22.0 g。

5 操作步驟

   所有擬評(píng)價(jià)菌株必須使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑給予動(dòng)物受試物，以評(píng)價(jià)不同受試物暴露途徑對(duì)動(dòng)物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌懸液制備

5.1.1.1 產(chǎn)孢子量大的菌株：將擬評(píng)價(jià)菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板（紅曲霉屬菌株接種麥芽汁瓊脂平板）或適于擬評(píng)價(jià)菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基平板，28℃±1℃培養(yǎng)7 d～14 d后，挑取平板上的孢子，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度，并用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整，使其較終濃度不**5.0×107 CFU/mL。

5.1.1.2 產(chǎn)孢子量少或不產(chǎn)孢子的菌株：將擬評(píng)價(jià)菌株接種于適宜的培養(yǎng)基上， 28℃±1℃下培養(yǎng)7 d～14 d或在適宜的誘導(dǎo)產(chǎn)孢條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，挑取平板的菌絲體及孢子，用球磨儀（或其他功能相當(dāng)?shù)膬x器）將菌絲體磨碎，經(jīng)生理鹽水重懸后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整，使菌懸液中菌絲體片段數(shù)/孢子的較終濃度不**5.0×107 CFU/mL。

5.1.2 注射

小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠生理鹽水對(duì)照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對(duì)照組、雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2 mL，即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.3 觀察

動(dòng)物腹腔注射后每天觀察1次，至少連續(xù)觀察21 d，觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

5.2 經(jīng)口灌胃

5.2.1 菌懸液制備

除制備的菌懸液中真菌孢子/菌絲體片段的濃度不**2.5×108 CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。

5.2.2 灌胃

小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠生理鹽水對(duì)照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對(duì)照組、雌性小鼠菌懸液組，各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃1次，灌胃前禁食過(guò)夜（16 h），灌胃后3 h～4 h喂食。

5.2.3 觀察

動(dòng)物經(jīng)口灌胃后每天觀察1次，至少連續(xù)觀察21 d，觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

6 結(jié)果與報(bào)告

對(duì)5.1和5.2的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和綜合評(píng)價(jià)，內(nèi)容同附錄A中的條款6。

 

附錄C

(規(guī)范性附錄)

   保健食品原料用酵母的致病性檢驗(yàn)方法

1 范圍

   本方法規(guī)定了保健食品原料用酵母的致病性檢驗(yàn)方法。

   本方法適用于保健食品原料用酵母的致病性檢驗(yàn)。

2 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1 恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃。

2.2 電子天平：感量為0.1 g。

2.3 錐形瓶：容量為500 mL。

2.4 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5 顯微鏡：10×～100×。

2.6 微量移液器及配套槍頭：量程為100 μL～1000 μL。

2.7 血球計(jì)數(shù)板。

2.8 注射器：量程為100 μL～1000 μL。

2.9 小鼠灌胃針頭。

2.10 溫濕度計(jì)。

2.11 接種環(huán)。

2.12 離心機(jī)：離心力33000 ′ g。

2.13 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

2.14 無(wú)菌量筒：容量100 mL。

3 培養(yǎng)基和試劑

3.1 麥芽汁瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2 麥芽汁培養(yǎng)基：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說(shuō)明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁培養(yǎng)基，備用。

3.3 無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水或8.5 g NaCl溶于1000 mL蒸餾水中，分裝后121℃高壓滅菌15 min，備用。

如擬評(píng)價(jià)菌株在麥芽汁培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)不理想，可選用適于該菌株生長(zhǎng)的其他培養(yǎng)基。

4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重范圍為18.0 g～22.0 g。

5 操作步驟

   所有擬評(píng)價(jià)菌株必須使用腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑給予動(dòng)物受試物，以評(píng)價(jià)不同受試物暴露途徑對(duì)動(dòng)物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌懸液制備

將擬評(píng)價(jià)菌株接種麥芽汁瓊脂平板，28℃±1℃培養(yǎng)一定時(shí)間（培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異）后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度，使菌懸液中菌的較終濃度不**5.0×107 CFU/mL。

5.1.2 注射

小鼠不少于40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組不少于10只），包括雄性小鼠生理鹽水對(duì)照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠生理鹽水對(duì)照組及雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2 mL，即受試物組每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。

5.1.3 觀察

動(dòng)物腹腔注射后每天觀察1次，至少連續(xù)觀察21 d，觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

5.2 經(jīng)口灌胃

5.2.1 菌株培養(yǎng)

將菌株接種到麥芽汁培養(yǎng)基上，28℃±1℃培養(yǎng)一定時(shí)間（培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短視不同菌種而異）后，備用。

5.2.2 菌數(shù)預(yù)估

無(wú)菌吸取上述5.2.1的培養(yǎng)液，分別加至兩個(gè)無(wú)菌離心管中，每管1 mL，3000 ′ g 離心10 min，棄去上清液后，用適量無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度并計(jì)數(shù)，使較終菌懸液中菌的濃度分別不**2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL，并分別記錄每mL培養(yǎng)液離心后所得沉淀物中酵母菌數(shù)調(diào)整至2.5×108 CFU/mL和6.25×108 CFU/mL時(shí)加入無(wú)菌生理鹽水的體積（mL）。

5.2.3 菌懸液制備

5.2.3.1 培養(yǎng)上清液的制備

根據(jù)受試動(dòng)物總數(shù)和每只動(dòng)物的灌胃體積計(jì)算所需要的受試菌株培養(yǎng)液用量，繼而將培養(yǎng)液一分為二，3000 ′ g 各離心10 min后，將上清液分別轉(zhuǎn)至100 mL無(wú)菌量筒中，一份上清液作為菌懸液原液的制備，另一份上清液冷凍濃縮至原體積的五分之二，作為2.5倍濃縮上清液，備用。

5.2.3.2 菌懸液原液的制備

按照5.2.2中獲得的酵母終濃度達(dá)到2.5×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積，按相同比例加入5.2.3.1獲得的上清液，調(diào)整離心后的沉淀物使其酵母數(shù)達(dá)到2.5×108 CFU/mL（上清液量不夠時(shí)可用空白培養(yǎng)基補(bǔ)齊）。

5.2.3.3 濃縮菌懸液的制備

按照5.2.2中獲得的酵母菌終濃度達(dá)到6.25×108 CFU/mL所需要的生理鹽水體積，根據(jù)離心的培養(yǎng)物體積，按相同比例加入5.2.3.1獲得的培養(yǎng)上清液2.5倍濃縮液，調(diào)整離心后的沉淀物使其菌數(shù)達(dá)到6.25×108 CFU/mL。

5.2.4 灌胃

小鼠不少于80只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成8組（每組不少于10只），包括雄性小鼠培養(yǎng)基對(duì)照組、雄性小鼠菌懸液組、雄性小鼠2.5倍濃縮培養(yǎng)基對(duì)照組、雄性小鼠2.5倍菌懸液組；雌性小鼠培養(yǎng)基對(duì)照組、雌性小鼠菌懸液組、雌性小鼠2.5倍濃縮培養(yǎng)基對(duì)照組及雌性小鼠2.5倍菌懸液組。各組均以20 mL/kg·BW的體積給小鼠灌胃1次，灌胃前應(yīng)禁食過(guò)夜（16 h），灌胃后3 h～4 h喂食。

5.2.5 觀察

動(dòng)物經(jīng)口灌胃后每天觀察1次，至少連續(xù)觀察21 d，觀察指標(biāo)同附錄A中的5.1.4。

6 結(jié)果與報(bào)告

對(duì)5.1和5.2的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和綜合評(píng)價(jià)，內(nèi)容同附錄A中的條款6。

 （信息來(lái)源：國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督總局；編發(fā)：北京天健華成國(guó)際投資顧問(wèn)有限公司 保健食品注冊(cè)）


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• 詞條

  詞條說(shuō)明

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  進(jìn)口產(chǎn)品原包裝上標(biāo)注了我國(guó)法規(guī)禁止標(biāo)注的內(nèi)容，如產(chǎn)品宣稱中有“抗炎癥成分”表述等，注冊(cè)或備案時(shí)應(yīng)當(dāng)如何申報(bào)？ 答：進(jìn)口產(chǎn)品原包裝標(biāo)注內(nèi)容不符合我國(guó)化妝品法規(guī)相關(guān)要求的，首先應(yīng)當(dāng)結(jié)合產(chǎn)品的使用方式、作用部位、使用目的等，判定該產(chǎn)品是否屬于我國(guó)法規(guī)規(guī)定的化妝品定義范疇。不屬于我國(guó)化妝品定義范疇的，不得按照進(jìn)口化妝品申報(bào)注冊(cè)或進(jìn)行備案。屬于化妝品定義范疇的，應(yīng)當(dāng)按照我國(guó)化妝品標(biāo)簽管理相關(guān)法規(guī)規(guī)定要求，對(duì)

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