奧林巴斯熒光顯微鏡優(yōu)化和故障排除

時間：2020-03-19作者：蘇州思凱得電子科技有限公司瀏覽：832

熒光顯微鏡的一個關(guān)鍵特征是它能夠檢測到相對于黑暗（通常是黑色）背景有時微弱可見或甚至非常明亮的熒光物體。為了優(yōu)化該特征，必須使用將在該部分引物中討論的原理來較大化圖像亮度和分辨率。

圖像亮度 - 優(yōu)化圖像亮度的較重要方面之一是確保為樣品提供足夠的光能，以便在適當(dāng)?shù)牟ㄩL下激發(fā)附著在樣品上的每個發(fā)色團。同樣重要的是選擇適當(dāng)?shù)钠琳线^濾器以較大化指向觀察管或攝像管的**熒光量。諸如汞和氙燃燒器的高能光源將在非常窄的近紫外和可見光范圍內(nèi)提供大量的激發(fā)能量。當(dāng)這些光源的使用耦合到能夠傳輸所選波長同時阻擋那些不希望的激發(fā)濾波器的適當(dāng)選擇時，將滿足激勵的較佳標(biāo)準(zhǔn)。

防止不需要的波長進(jìn)入觀察管的阻擋濾光器的選擇是主要關(guān)注點。激發(fā)的總能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于**能量，因此選擇一種有效的屏障濾波器非常重要，它可以阻擋不需要的波長，同時允許樣品的熒光**通過。選擇用于熒光的物鏡必須能夠在近紫外區(qū)域和整個可見光譜中有效地透射光。

鑒于發(fā)光水平較低，物鏡在熒光顯微鏡中的作用至關(guān)重要，因為它是從樣品中收集光的物鏡功能。物鏡接受的光錐角度由物鏡的數(shù)值孔徑（NA）決定，如圖1所示。在透射光熒光顯微鏡中，到達(dá)眼睛或其他探測器的光強度直接變化為物鏡和聚光器的數(shù)值孔徑的平方與總放大倍數(shù)的平方成反比。

另一方面，在反射光熒光中，圖像的強度直接隨著使用物鏡的數(shù)值孔徑的四次方而變化，并且與數(shù)值總放大率的平方成反比：

I = NA4 / Mag2

這種差異是由于物鏡較初用作聚光燈，用于將光線聚集在樣品上，然后作為通常的光線收集器用于圖像形成。其含義是顯而易見的：高數(shù)值孔徑物鏡將產(chǎn)生比具有較低數(shù)值孔徑的相同放大物物鏡具有較高強度的圖像。例如，在其他條件相同的情況下，NA為1.0的40X物鏡將產(chǎn)生比數(shù)值孔徑為0.65的40X物鏡亮5倍以上的圖像。進(jìn)一步的暗示是，如果可能的話，與較常用的10X觀察目鏡相比，使用較低放大率的視覺目鏡（例如8倍放大率）也將增加圖像的亮度。另外，在反射光熒光中，激發(fā)光僅通過物鏡（在其作為聚光鏡的功能）集中在被觀察的區(qū)域上。結(jié)果，激發(fā)光的強度遠(yuǎn)**透射光暗場熒光，其中被激發(fā)的區(qū)域隨著物鏡的改變而不改變。同樣在暗場中，物鏡的數(shù)值孔徑必須減小到**聚光鏡的數(shù)值孔徑，以保持視場的暗度。

除了數(shù)值孔徑是一個重要的考慮因素之外，建議具有較高質(zhì)量的色度校正的物鏡，因為在同一平面中的各種顏色的聚焦將產(chǎn)生較清晰的圖像。此外，球面校正越好，圖像越清晰。因此，選擇的物鏡是平場復(fù)消色差物鏡或平場熒光物鏡。這些應(yīng)設(shè)計成當(dāng)用400納米波長的光（近紫外光）照射時，透鏡元件及其粘固劑本身不會自發(fā)熒光。

在可能的情況下，應(yīng)采用油浸物鏡，以盡量減少玻璃載玻片和蓋玻片表面反射造成的光損失。現(xiàn)代顯微鏡制造商努力提供完全不含自發(fā)熒光污染物的光學(xué)元件，但也應(yīng)考慮這一方面，因為自發(fā)熒光會通過增加背景亮度來降低樣品對比度。

圖像分辨率 - **顯微學(xué)會（RMS）標(biāo)準(zhǔn)厚度，適用于0.17mm的玻璃蓋玻片。由于制造過程中的波動，在蓋玻片的統(tǒng)計抽樣中，該數(shù)量存在輕微的變化（通常在0.01mm和0.03mm之間）。高數(shù)值孔徑“干”物鏡較容易受到這些變化的影響，并且許多物鏡都配有校正環(huán)允許顯微鏡師微調(diào)玻璃厚度的物鏡校正。購買高度精確的蓋玻片并確保物鏡校正項圈得到較佳調(diào)整非常重要。此外，一些制造商提供包含內(nèi)部可變光闌的**物鏡，如圖2中的100X復(fù)消色差奧林巴斯物鏡所示。如果使用的物鏡是使用的，則應(yīng)通過適當(dāng)調(diào)節(jié)該可變光闌（圖2）來較小化眩光。如此裝備。

使用油浸物鏡時，在使用后用紙巾擦拭前鏡片以去除油污，并確保定期用適當(dāng)?shù)娜軇┣鍧崳ㄍǔＣ吭录s一次就足夠了）。浸沒物鏡上留下的過多油會吸收空氣中的灰塵并降低圖像質(zhì)量和分辨率。此外，確保浸油不含PCB，具有非常低或不存在的自發(fā)熒光水平，并應(yīng)用于物鏡 - 蓋玻片界面而不形成氣泡。

應(yīng)仔細(xì)調(diào)整顯微鏡的光路，以確保所有組件都按照設(shè)計正確放置和執(zhí)行。如我們對熒光顯微鏡光源的討論中所述，光源弧應(yīng)正確對準(zhǔn)。




清潔光學(xué)元件 - 熒光顯微鏡（以及所有其他形式的顯微鏡）的**條規(guī)則是保持光學(xué)元件完全沒有灰塵，污垢，油，溶劑和任何其他污染物。顯微鏡應(yīng)保存在低振動**室內(nèi)，盡可能清潔并且對循環(huán)空氣的干擾較小。不使用時，請在顯微鏡上使用防塵罩，并將所有配件放在不透氣的容器中。避免使用腐蝕性溶劑清潔顯微鏡的任何部分，并僅使用稀釋的肥皂水清潔非光學(xué)表面。應(yīng)使用以下提示保持物鏡清潔：

切勿以高壓力（包括鏡頭紙）在鏡頭表面上拖動任何物體，以避免在表面上引入非常細(xì)小的劃痕。

使用專為光學(xué)表面設(shè)計的溶劑清潔鏡頭，或在緊急情況下使用無水乙醇清潔鏡頭。避免使用其他溶劑，因為它們可能會與玻璃上的光學(xué)涂層反應(yīng)。

在用溶劑清潔之前，用壓縮氣體對鏡頭表面進(jìn)行除塵，以去除松散的顆粒。

用鏡頭清潔劑或乙醇浸泡Q-tip，并在鏡片上輕輕擦拭幾次，每次通過前轉(zhuǎn)動棉簽。用鏡頭紙擦去多余的溶劑，讓鏡頭徹底干燥。重復(fù)此過程。

如上所述，可以用溶劑清潔油浸透鏡。切勿使用含干燥物鏡的油，因為清潔干燥物鏡可能比專門設(shè)計用于油的物鏡要困難得多。

進(jìn)一步的優(yōu)化和故障排除 - 在理想情況下，所有顯微鏡檢查都應(yīng)在黑暗的房間內(nèi)進(jìn)行，但這對熒光顯微鏡尤為重要。人眼很難快速適應(yīng)黑暗，在房間變暗后很難立即辨別出一個非常昏暗的熒光標(biāo)本。在不查看或拍攝樣品時，通過阻擋激發(fā)光來避免樣品過度漂白。在安裝之前，通過徹底清洗樣品以去除多余的熒光染料，較大限度地減少自發(fā)熒光。有關(guān)一般問題解決和故障排除的其他方面，請參閱下面的表1。

問題	原因	補救
光學(xué)系統(tǒng)
燈泡亮起，但 無法看到圖像或暗淡。	快門旋鈕關(guān)閉 或正在使用ND濾鏡。	移動快門打開光圈。 移除ND濾鏡。
	激發(fā)塊未正確旋轉(zhuǎn)到光路中。	將激發(fā)塊正確旋轉(zhuǎn)到光路中。
	激發(fā)濾波器和屏障濾波器組合不正確。	遵循熒光染料的濾光片組合。
	光圈可變光闌，視場光圈光闌或物鏡光圈光圈開口未完全打開。	完全打開光圈可變光圈和物鏡的光圈光圈開口，打開 光圈光圈開口，直到其圖像圍繞 視野。
	使用不適合 樣品的激發(fā)塊。	更改為合適的激發(fā)塊。
圖像不清晰，模糊或?qū)Ρ榷炔蛔恪?/td>	或過濾器很臟。	擦拭干凈
	激發(fā)濾波器和屏障濾波器組合不正確。	遵循熒光染料的濾光片組合。
	光圈可變光闌或 視場光圈光圈開口未正確打開。	完全打開光圈可變光圈，打開可變光圈光闌，直到其圖像圍繞視野。
	使用不適合 樣品的激發(fā)塊。	更改為合適的激發(fā)塊。
圖像部分遮擋或不均勻照明。	物鏡未 正確插入光路。	旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)物鏡， 直到聽到咔嗒聲。
	激發(fā)塊未正確旋轉(zhuǎn)到光路中。	正確地將激發(fā)塊旋轉(zhuǎn)到光路中。
	視場可變光闌開口過度關(guān)閉。	根據(jù)需要打開視場可變光闌。
	快門滑塊沒有被推得足夠遠(yuǎn)。汞燈未正確居中，或者焦點調(diào)整尚未完成。	將快門滑塊完全推入。使汞燈居中或調(diào)整焦距。
過度刺眼	未插入激發(fā)濾波器或屏障濾波器。	插入所需的過濾器
電子系統(tǒng)
電源開關(guān)指示燈不亮	電源線連接不正確。	正確連接
電源開關(guān)指示燈，但汞燈燃燒器沒有	連接器連接不正確。燃燒器尚未安裝	正確連接。 安裝燃燒器。
	燈罩互鎖正在運行。	牢固地擰緊燈泡插座鎖定螺釘。
	自動點火不按要求運行	關(guān)閉電源裝置的電源。再次打開。（必要時重復(fù)。）
燈泡閃爍或變暗	自燃燒器打開后經(jīng)過的時間不足	打開燃燒器后等待10分鐘
	燈泡壽命已經(jīng)過期。	如果壽命計讀數(shù)**過200小時，則更換汞燈（燈泡的使用壽命在100到300小時之間）


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• 詞條

  詞條說明

• 奧林巴斯暗場顯微鏡故障排除

  問題：照明不足以使樣品可見，或者樣品可見但非常暗淡。解決：燈泡電壓可能設(shè)置得太低，或者燈泡強度不足以正確照亮樣品。將電壓升至較大約12V（對于12V，100W鹵素?zé)襞荩?，或者在可能的情況下用較大的強度更換光源。如果這樣不能解決問題，請檢查底下聚光鏡，以確保其位置正確，并且具有合適尺寸的視場光闌。另外，請檢查彩色和/或中性密度濾光片，偏光片，延遲片或可能降低照明強度的任何其他組件的光路。?

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