提取染色體DNA和質粒DNA的方法

時間：2020-01-05

一、質粒構建原理

在堿性條件下，染色體DNA和質粒DNA都發(fā)生變性，但質粒DNA的**螺旋共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈不會*分離，當用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，纏結的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質—SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通過離心得到質粒DNA沉淀。

二、質粒構建試劑

1、LB培養(yǎng)基

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待*溶解后，用1N NaOH調pH至7.0，補加重蒸水至總體積1000ml，151bf/in2高壓蒸氣滅菌20分鐘。

2、氨芐青霉素：100mg/ml

3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris—HCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)

4、溶液Ⅱ(臨用時配)：0.2mol/L NaOH，1％SDS

5、溶液Ⅲ：0.5mol/L乙酸鉀60ml；冰乙酸11.5ml；H2O28.5ml

6、酚－氯仿：將酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L Tris－HCl (pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋0.01mol/L Tris－HCl (pH7.6)液層，4℃保存。

7、氯仿－異戊醇：將氯仿和異戊醇按24：1的比例混合。

8、TE緩沖液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT

9、RNase 1mg/ml：稱10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，此液為10mg/ml RNase濃度，應用時稀釋至1mg/ml。

10、70％乙醇、無水乙醇

三、質粒構建操作

1、將含有pBS-SK質粒的大腸桿菌XL1-blue 10μl接種到10ml含氨芐青霉素(100μg /ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃振搖過液。

2、取1.5ml菌液轉入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，吸凈上清。

3、將細菌沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。

4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，輕緩顛倒Eppendorf管5次，以混合內容物，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置5分鐘。

5、加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，反復顛倒數(shù)次，使溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，隨后置冰浴中5分鐘。

6、用微量臺式高速離心機12000rpm 離心5分鐘，將上清轉入另一Eppendorf管中。

7、加等體積酚－氯仿，劇烈振蕩1分鐘后，12000rpm離心5分鐘，將上層液轉入另一Eppendorf管中。

8、加等體積氯仿－異戊醇，劇烈振蕩10秒鐘后，短暫離心12000rpm1分鐘，將上層液轉入另一Eppendorf管中。

9、室溫下加2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，室溫下靜置5分鐘。

10、12000rpm離心5分鐘，去上清液，加1ml 70％乙醇，短暫振搖，然后再離心(12000rpm

分鐘)。

11、除去所有上清液，待待殘余乙醇揮發(fā)干凈后，加30μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37℃保溫15分鐘，取出后即可用于酶切分析或置-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

詞條
詞條說明
地坪施工選南亞環(huán)氧樹脂**效果好
廣旭的南亞環(huán)氧樹脂在市場中是大受歡迎的，其效果非常的令人滿意，美觀度也高，因此很多人選擇使用這種材料作為自流平地坪的主要原因。南亞環(huán)氧樹脂自流平地坪因為其美觀，**，防塵，所以首要合用于對干凈要求高的醫(yī)藥出產車間，電子廠房和辦公室等區(qū)域。南亞環(huán)氧樹脂自流平地坪的美觀首要由于該地坪資料具有良好的流平性，可以本人主動流平，所以平坦度高，光澤度高。但在環(huán)氧自流平實踐施工進程中，偶然會呈現(xiàn)地坪發(fā)花的
提取染色體DNA和質粒DNA的方法
一、質粒構建原理在堿性條件下，染色體DNA和質粒DNA都發(fā)生變性，但質粒DNA的**螺旋共價閉合環(huán)狀結構的兩條互補鏈不會*分離，當用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，纏結的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質—SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質粒DNA因不溶于70％的乙
祝夢想成真：園藝的同學即將要開始一段全新的追夢旅程
杭州花卉租賃報訊：近日某所園藝系的同學們即將要面臨畢業(yè)，此時此刻的他們又有什么樣的夢想呢？我們一起去看看他們的青春追逐！激動的歡呼、熱烈的掌聲，追逐著簽名、留影……對這些懷揣著園林花藝夢求學的孩子來說，二十多歲就已獨立創(chuàng)建自己的花藝工作室，并在北京**婚禮花藝界聲名鵲起的曹雪，就是他們心中的大**?！皠?chuàng)業(yè)過程很艱苦，前兩年工作室都不贏利甚至虧損，但是今年，我有把握賺到一百萬！我不做投資理財，也
做實驗完成對環(huán)氧樹脂的韌性功能的研究
科研人員總是無私奉獻于南亞環(huán)氧樹脂的研究當中，他們以嚴謹?shù)膽B(tài)度、積極投身于這個環(huán)氧樹脂的研究中，增強此類產品的功能。? 橡膠彈性體的類型? 當前用于南亞環(huán)氧樹脂增韌EP的反響性橡膠及彈性體首要包羅端羧基丁腈橡膠（CTPB）、端羥基丁腈橡膠（HTBN）、端環(huán)氧基丁腈橡膠和聚硫橡膠等。Chikhi[6]等用端氨基丁腈橡膠（ATBN）改善EP的韌性，南亞環(huán)氧樹脂并對其熱力學功能和玻