質(zhì)粒DNA構(gòu)建的酶切目的、原理、器材、試劑、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

時(shí)間：2020-01-05

II型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈質(zhì)粒構(gòu)建DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。

1．目的

學(xué)會(huì)用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。

2．原理

II型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。

3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴。

4．試劑

Pinpoint?xa-3質(zhì)粒，EcoR V，BamH I，內(nèi)切酶緩沖液（10×），10×電泳加樣緩沖液，熒光染料。

5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

配制TAE電泳緩沖液（50′儲(chǔ)存液），細(xì)胞轉(zhuǎn)染10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。

6．操作步驟

（1）混合下列溶液于一個(gè)無菌的1.5ml微量離心管中：

Pinpoint?xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl

10×酶切緩沖液（用EcoRV的緩沖液） 2 μl

ddH2O 30 μl

EcoRV 1μl

BamHI 1μl

總體積 40μl

（2）先準(zhǔn)備一個(gè)冰盒并放入一定量的冰塊。從-20℃冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。

（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性內(nèi)切酶。

（4）在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜！），輕輕震動(dòng)微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在**的較適酶切溫度水浴中溫育1~3 h（一般是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物）對(duì)比電泳，以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。

（6）酶切后的質(zhì)?？梢曰厥諅溆茫ㄒ妼?shí)驗(yàn)六：從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段）。

（7）清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗(yàn)儀器。撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

詞條
詞條說明
提取染色體DNA和質(zhì)粒DNA的方法
一、質(zhì)粒構(gòu)建原理在堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA都發(fā)生變性，但質(zhì)粒DNA的**螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，纏結(jié)的染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質(zhì)粒DNA因不溶于70％的乙
質(zhì)粒DNA構(gòu)建的酶切目的、原理、器材、試劑、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
II型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈質(zhì)粒構(gòu)建DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。 1．目的學(xué)會(huì)用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。 2．原理 II型限制性內(nèi)切酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識(shí)別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。 3．器材旋渦混合器，微量移液
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