登革熱的檢驗方法

時間：2023-07-21作者：廣州華南生物工程有限公司瀏覽：455

確診登革熱病毒感染的實驗室檢測方法包括分離登革病毒、檢測病毒的核酸、抗原或抗體或幾種檢測方法的聯(lián)合使用。從病人標本中分離到登革病毒，檢測到病毒核酸、抗原，血液中IgM抗體陽轉(zhuǎn)，或恢復期血標本IgG抗體滴度較急性期有4倍或以上升高可以確診登革病毒感染。單份血標本IgM或IgG抗體陽性不能確診登革病毒感染，單份標本抗體檢測陽性時，僅可臨床診斷為疑似或可能病例，確診需要急性期和恢復期雙份血清標本。

（一）登革病毒感染與機體*反應

登革病毒感染后，潛伏期為3～14天，通常4～7天，潛伏期內(nèi)采集的患者標本尚不能檢出登革病毒或相應的機體*反應。發(fā)病后，病毒在血液中存在的時間（病毒血癥期）約為7天，病毒NS1抗原在血液存在的時間略長。發(fā)病后4～5天內(nèi)，可在病人的血清、血漿、白細胞、腦脊液和尸檢組織標本中分離到病毒，病毒核酸及NS1抗原在這個時期的檢出率高。病人血液中抗體水平，因個體*狀態(tài)不同而具有顯著差異。若以前沒有感染過登革病毒或其他黃病毒，或接種過黃病毒疫苗（如：乙腦、黃熱等），病人**感染抗體*反應呈現(xiàn)為特異性抗體水平緩慢升高，IgM抗體出現(xiàn)較早，隨后出現(xiàn)的是IgA和IgG抗體。在發(fā)病后3～5天的患者中IgM抗體檢出率約為50%，發(fā)病后*5天的患者中檢出率約為80%，而在發(fā)病后*10天患者中，約99%的患者可檢出。IgM抗體水平在發(fā)病后2周達高峰，然后逐步下降，可保持2～3個月。IgA抗體出現(xiàn)略晚于IgM抗體，可保持約45天。在發(fā)病一周后，可在血液標本中檢出較低滴度的IgG抗體，之后抗體滴度緩慢升高，可持續(xù)存在多月甚至終生。如果病人屬于再次感染登革病毒（登革病毒感染者以前曾感染過登革病毒，有時可能是曾接種其他黃病毒疫苗或感染過其他黃病毒），抗體滴度可快速升高并可和多種黃病毒產(chǎn)生反應。主要為高水平的IgG抗體，在急性期即可檢出，可持續(xù)存在10個月以上，甚至終生。IgA抗體也可在急性期標本中檢出。再次感染登革病毒的病人恢復期早期的IgM抗體滴度明顯****感染，甚至無法檢出，通過計算IgM/IgG抗體比例，可以區(qū)分**或再次登革病毒感染。IgA抗體檢測試劑在臨床診斷中的應用尚處于評價階段。

（二）檢測方法選擇

在發(fā)病的早期（發(fā)病5天內(nèi)）一般采用病毒分離、核酸檢測或抗原檢測等方法進行診斷，當病程進入恢復期后（發(fā)病5天以后），一般采用血清學檢測病毒特異性抗體的方法進行診斷。

1.病毒分離。經(jīng)細胞培養(yǎng)分離病毒，需要生物安全二級（BSL-2)實驗室及必要的儀器設(shè)備，在標本運輸過程中保持低溫（冷凍或冷藏）對于病毒分離非常重要。將標本接種于蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測抗原或核酸的方法鑒定病毒。分離到登革病毒可以確診，但其耗時長，需要數(shù)天，不適于快速診斷。

2.核酸檢測。多種逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法可用于登革病毒核酸檢測，包括一步法RT-PCR、實時熒光RT-PCR或套式RT-PCR等方法等。核酸檢測可在1～2天內(nèi)鑒別病毒RNA。在病人標本中檢出病毒核酸，可確診且能分型，可用于早期診斷，但核酸檢測容易因污染而產(chǎn)生假陽性，因此要求嚴格分區(qū)操作。陰性結(jié)果不能排除登革熱診斷，需采集*二份標本（發(fā)病5天后）開展血清學檢測，進行確診。

3.抗原檢測。NS1抗原檢測可采用ELISA方法或快速檢測試劑，可在幾十分鐘到數(shù)小時完成檢測，適于現(xiàn)場使用，是登革熱急性期診斷的重要手段，在發(fā)病后1天即可檢出，也有報道在發(fā)病后18天仍可在血標本中檢出。目前該方法尚不能分型。由于NS1抗原檢測方法的特異性，也可用于黃病毒感染的鑒別診斷。基于我國登革熱流行的特點，國家衛(wèi)生計生委頒發(fā)的《登革熱診療指南（2014年*2版）》將標本中檢出NS1抗原作為確診病毒感染依據(jù)，可用于早期診斷。但綜合現(xiàn)有試劑的穩(wěn)定性和特異性以及現(xiàn)場疫情處置需要等因素考慮，《登革熱診斷標準WS 216-2018》將標本中檢出NS1抗原作為臨床診斷病例標準而非確診病毒感染依據(jù)。NS1抗原檢測陰性結(jié)果不能排除登革熱診斷，需采集*二份標本（發(fā)病5天后）開展血清學特異性抗體檢測，進行確診或排除診斷。

4. IgM抗體檢測。用于IgM抗體檢測的捕獲法ELISA（MAC-ELISA）是較常用的檢測方法，也有多種商業(yè)化快檢試劑可用于IgM抗體檢測，均不能用于血清分型檢測。目前檢測試劑主要是檢測病毒包膜蛋白特異性抗體，主要缺陷為與其他黃病毒存在交叉反應。標本中IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷，但單份標本不能確診。一些登革病毒再次感染者，血標本中IgM抗體滴度底，甚至不能檢出，影響IgM抗體診斷精確性。

5. IgG抗體檢測?？刹捎?/span>ELISA、*熒光（IFA）、*層析等方法檢測。登革病毒IgG抗體與其他黃病毒有交叉反應。IgG抗體檢測可以用來鑒定**感染和再次感染，如果急性期標本IgG抗體陰性，恢復期陽轉(zhuǎn)，則可確定為**感染；如果急性期患者血標本中IgG/IgM比值明顯升高（受抗體檢測試劑盒敏感性影響，尚無明確的指示值），或發(fā)病后3天內(nèi)IgG水平明顯升高，提示再次感染；患者恢復期血標本IgG抗體滴度較急性期(兩份標本間隔應不少于7天）呈4倍及以上升高可確診為登革病毒感染。采集*二份標本進行確診或排除診斷對于登革熱防控具有重要意義，尤其是非流行區(qū)。

6.中和抗體檢測。空斑減少中和實驗（Plaque Reduction and Neutralization Test，PRNT）和微量中和實驗可用來檢測血清中的中和抗體，是型特異的血清學檢測方法，可以分型。需要生物安全二級（BSL-2)實驗室及必要的儀器設(shè)備，耗時長，需要數(shù)天，不適于快速診斷?；颊呋謴推谘逯泻涂贵w陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診。



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• 登革熱的檢驗方法

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