百螢問號：熒光鬼筆環(huán)肽及其綴合物常見問題解答

時間：2024-03-25

鬼筆環(huán)肽是鬼筆毒素家族的主要代表，是一種雙環(huán)七肽，是從有毒的死亡帽蘑菇傘形毒蕈中分離出來的。它對F-肌動蛋白亞基之間的凹槽具有很高的親和力。一旦與F-肌動蛋白結合，鬼筆環(huán)肽就會使單體和長絲的平衡向長絲位置移動，并抑制ATP水解。相互作用通過防止亞基解離來穩(wěn)定肌動蛋白絲，并通過降低臨界濃度促進肌動蛋白聚合。結果，這些特性使得鬼筆環(huán)肽衍生物成為可視化F-肌動蛋白和細胞骨架網(wǎng)絡的有用染色劑。本周百螢主要想帶大家了解一下關于鬼筆環(huán)肽、肌動蛋白以及染色過程中經(jīng)常遇到的問題。

1.我可以用固定細胞，然后用熒光鬼筆環(huán)肽染色嗎？

可以使用固定細胞。請根據(jù)實驗條件選擇固定方法。用甲醛、多聚甲醛或固定細胞后，用鬼筆環(huán)肽綴合物（例如鬼筆環(huán)肽-iFluor 488）染色效果較佳。

2.在用鬼筆環(huán)肽染料綴合物對肌動蛋白染色之前，應如何固定樣品？

避免使用含的固定劑，因為它會在固定過程中會破壞肌動蛋白。優(yōu)選的固定劑是不含的甲醛。

3.在用鬼筆環(huán)肽-iFluor 綴合物對F-肌動蛋白染色之前，我需要對石蠟包埋的組織切片進行脫石蠟處理嗎？您可以提供脫石蠟方案嗎？

是的，使用任何熒光鬼筆環(huán)肽綴合物對F-肌動蛋白染色，都將石蠟包埋的組織切片去石蠟（去除石蠟）。

去除組織切片的石蠟：

將切片加熱到57°C持續(xù)5分鐘。

將切片浸入2次中，每次5分鐘。

將切片分別浸入100％，95％和70％的乙醇中，每次5分鐘。

用1X PBS洗滌2次，每次5分鐘。

進行F-肌動蛋白標記。

4.甲醛和多聚甲醛在細胞固定方面有什么區(qū)別？

多聚甲醛（PFA）是甲醛的聚合物。多聚甲醛本身不是固定劑，需要溶解成甲醛?？梢酝ㄟ^加熱或在堿性條件下溶解得到甲醛。

福爾馬林 是飽和（37％）的名稱。但是請注意，某些商業(yè)中含有以防止聚合（轉化為多聚甲醛）。由于100％福爾馬林含有高達15％的作為穩(wěn)定劑，因此對細胞固定有很大影響。

是一種滲透劑。它可以干擾膜結合蛋白的染色，并且可以大地影響細胞骨架蛋白的染色。例如，當染色細胞F-肌動蛋白時，使用不含的甲醛固定劑。這是因為可以在固定過程中破壞F-肌動蛋白并阻止鬼筆環(huán)肽綴合物的結合。

5.鬼筆環(huán)肽對細胞滲透嗎？

鬼筆環(huán)肽不是細胞可滲透的，因此不能在活細胞上使用。熒光標記的鬼筆環(huán)肽，例如Phalloidin-iFluor 488綴合物，只能在甲醛固定和透化的組織切片、細胞培養(yǎng)和無細胞實驗中用于對F-肌動蛋白染色。

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