DNA甲基化服務(wù)檢測(cè)服務(wù)

時(shí)間：2012-05-16作者：上海藥巢生物工程有限公司瀏覽：25

 

DNA化服務(wù)檢測(cè)

結(jié)合重鹽的測(cè)序法實(shí)驗(yàn)流程（BSP） （Bisulfite Genomic Sequence）     原理：結(jié)合重鹽的測(cè)序法是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA化模式的方法。重鹽處理后，用針對(duì)改變后的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。 PCR產(chǎn)物中原先非化的胞嘧啶位點(diǎn)被胸腺嘧啶所替代，而化的胞嘧啶位點(diǎn)保持不變。PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測(cè)序。通過這個(gè)方法能得到特定位點(diǎn)在各個(gè)基因組DNA分子中的化狀態(tài)。該方法特點(diǎn)是： 1. 特異性高，它能夠提供特異性很高的分析結(jié)果，這是所有其他研究化的分析方法所不能比擬的； 2. 靈敏度高，可以用于分析少于100個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)樣品。用微量的基因組DNA進(jìn)行分析就能得到各個(gè)DNA分子精確的化位點(diǎn)分布圖。

圖1 結(jié)合鹽的測(cè)序法流程圖。DNA用重鹽處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段純化后連接進(jìn)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，過夜培養(yǎng)后挑單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。得到每個(gè)DNA分子特定區(qū)域化位點(diǎn)的分布圖。

 

結(jié)合重鹽測(cè)序法技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程

A．DNA制備

用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細(xì)胞培養(yǎng)物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。

B．重鹽處理

C．DNA純化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重鹽處理后的DNA樣品。

D．DNA脫磺基反應(yīng)

E．PCR擴(kuò)增

F．PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后回收純化，隨后連接到pGEM-T EASY 載體中克隆及測(cè)序。

 

化特異性的PCR實(shí)驗(yàn)流程

（methylation-specific PCR, MSP）

原理：化特異性的PCR是一種靈敏度高且操作相對(duì)簡(jiǎn)單的化研究方法。重鹽處理DNA后，基因組DNA發(fā)生的由化狀態(tài)決定的序列改變。隨后進(jìn)行引物特異性的PCR。該方法引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。MSP中設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，即一對(duì)結(jié)合處理后的化DNA鏈（引物對(duì)M），另一對(duì)結(jié)合處理后的非化DNA鏈（引物對(duì)U）。檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用引物M能擴(kuò)增出片段，則說明檢測(cè)位點(diǎn)存在化；若用引物U擴(kuò)增出片段，則說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在化（圖3）。該方法優(yōu)點(diǎn)是：

l      檢測(cè)靈敏度高，樣品消耗少，僅需1μg的基因組DNA，可用于石蠟包埋樣本；

l      快速、簡(jiǎn)單，省時(shí)；

l      如果結(jié)合Real-time定量PCR技術(shù)（Taqman 探針）則能對(duì)樣品中檢測(cè)位點(diǎn)的化水平進(jìn)行定量檢測(cè)(Methylight)。

圖2 化特異性的PCR（MSP）流程示意圖。用鹽處理后DNA分子發(fā)生了由化狀態(tài)決定的序列改變。用化特異性的引物（primer M）和非化特異性的引物（primer U）進(jìn)行擴(kuò)增。只有結(jié)合完全的化或

MSP技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程

A．DNA抽提

用DNA抽提試劑盒（Promega, cat. no. A1125）抽提組織，細(xì)胞培養(yǎng)物，石蠟包埋組織切片樣品中的基因組DNA。

B. 重鹽處理

C．DNA純化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)純化重鹽處理后的DNA樣品。

D．DNA脫磺基反應(yīng)

E．化特異性的PCR反應(yīng)

針對(duì)改變后的DNA序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（M，U），進(jìn)行PCR反應(yīng)。為了避免非特異性擴(kuò)增用TaKaRa的hotstart酶。隨后對(duì)PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖進(jìn)行分析。

實(shí)例：

檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因啟動(dòng)子化。重鹽處理后，針對(duì)改變的DAN序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物

M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp

U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp




圖3 Bel 7404細(xì)胞系SFRP1基因啟動(dòng)子被完全化，Bel 7405細(xì)胞系該基因啟動(dòng)子被部分化。


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